中秋白癜风治疗 http://news.39.net/bjzkhbzy/201001/8263830.html问题的提出显微注射法是研发最早也是最成熟和应用最广的转基因技术，该方法是Gordon等人发明的，基本原理是通过显微注射仪将外源基因直接注射到受精卵的雄原核内，使外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。年Palmiter应用此法获得转基因的“超级小鼠”引起世人瞩目。显微注射技术可以广泛应用于多个领域，如体外受精、胚胎工程。显微注射技术也在不断改进，如一开始没有用载体，也就是没有重组DNA的形成，后来用到了载体。问题：教材中仅仅提到显微注射技术，没有具体的内容，显微注射技术是怎么样的一个过程？需要哪些操作流程？
典型试题解析
的形态
试题：下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述中，错误的是（
）
A.农杆菌转化法是获得转基因植物的比较经济和有效的方法
B.显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法
C.大肠杆菌最常用的转化方法是使细胞的生理状态发生改变
D.早期的基因工程操作一般不用原核生物作为受体细胞
解析：
在自然条件下，农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法，A正确；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞最有效的方法，B正确；Ca2+处理法能使大肠杆菌细胞的生理状态发生改变，按照浙科版教材认为是增加细胞壁的通透性，使之成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态，C正确；由于细菌等微生物繁殖速度非常快、且多为单细胞，并且遗传物质相对较少，因此在基因工程技术中，科学家常用细菌等微生物作为受体细胞，细菌为原核生物，D错误。故答案为D。
受精卵原核显微注射法
的形态
DNA显微注射法的基本过程包括转基因载体的准备、胚胎操作和显微注射、转基因动物的鉴定和培育。
1.所需的实验器材
显微操作需要以下主要设备：倒置显微镜、显微操作系统、显微注射系统、体视镜、锻针仪和显微手术器械。倒置显微镜需要配置DIC功能，微分干涉差显微镜（DIC）的优点是能显示三维立体结构，便于直接将DNA注入细胞核内。
显微操作系统主要包含：三维电动粗调微操作手、三维液压式微操作手、持针器、持针器夹持架、显微镜支架。显微注射仪使用可将微量的DNA、RNA、蛋白质，注入受精卵的雄性细胞核内。
显微注射系统辅助设备有激光破膜系统或Piezo机械打孔，适用于多种物种胚胎透明带的薄化，可显著提高ES细胞注射成功率。在体视镜下操作，获取和冲洗胚胎。
2.显微注射获取转基因鼠操作过程
操作流程示意图
（1）目的基因的制备与纯化
可以通过限制性内切酶预先分离的某一基因，逆转录法得到的cDNA，人工合成的DNA片段，聚合酶链式反应(PCR)扩增的特定基因片段等方法。
目的基因的克隆可以通过载体方式进行，通常选择质粒作为载体。将目的基因与质粒结合形成重组子，然后转化至大肠杆菌，扩增质粒，再分离纯化重组质粒DNA，用适当的限制性内切酶消化，制备成线状基因片段备用。目的基因的克隆也可以通过PCR来实现。
（2）卵供体母鼠和假孕母鼠的准备
定期准备相当数量的卵供体母鼠和假孕母鼠以及一批相对稳定的正常雄鼠与结扎雄鼠。假孕母鼠（受体鼠）的准备是DNA显微注射前一天，将C57BL/6母鼠（模型鼠）与结扎的公鼠交配，第二天早上检查小鼠，有阴道栓的母鼠为假孕鼠。
（3）超排卵与取卵
选择4~6周龄母鼠，注射孕马血清促性腺激素(PMSG)后，隔42~48h再注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)，注射HCG后10~13h剖取卵，用培养液保存，置CO2培养箱备用。
（4）基因显微注射
用专门的持卵管和注射针在显微注射仪上操作，将纯化的目的基因注射到受精卵雄性原核内。
动物卵受精后，在两生殖核发生融合之前，可将卵分为含雌原核的卵块和含雄原核的卵块两部分，通常来自精子的雄性原核较大，能容纳更多的外源DNA，且含雄原核的卵块的发育能力要比含雌原核卵块的发育能力强，因此一般都是向雄性原核注入DNA溶液。
（5）受精卵移植
转基因受精卵在单细胞至桑葚胚阶段移植到受孕后0.5d的假孕母鼠的输卵管，在囊胚期则移植到受孕后2.5d的假孕母鼠子宫。每只假孕母鼠移植20~30个转基因卵为宜。
（6）目的基因的表达整合鉴定和检测
从假孕母鼠产下的幼鼠尾尖提取DNA，用PCR、DNA印迹、FLSH(荧光原位杂交)等方法在染色体及基因水平上进行整合鉴定，并通过RNA印迹和蛋白质印迹等方法在转录及蛋白质水平上进行表达检测。经检测获得阳性Founder小鼠(首建鼠)。
（7）建近交系
将阳性Founder小鼠与同一品系的正常小鼠交配，检测F1代仔鼠的阳性率，当繁殖到阳性率为50%左右时基本上可以判断出外源目的基因为单一位点的整合。经扩大繁殖，从中选择外源目的基因表达效果好、适应性好的转基因小鼠进行近亲繁殖。然后从子代中选择理想的纯合子个体进行全同胞兄妹交配，建立遗传基因小鼠近交系。
3.显微注射法的基本原理和优点
基本原理：在显微镜下用一个表面光滑的玻璃持针吸住受精卵，用另外一个很细的玻璃针将DNA溶液直接注入受精卵的雄原核里。将注射过的受精卵移入受体动物的输卵管中，发育成子代动物。
优缺点：简单快速、周期短，现在已成为经典的方法。
由于注射针很细，限制了注射的DNA的大小。转基因动物制备的难度，随着DNA片段的长度增加而增大。最常用的为质粒DNA，大小为10kb左右；大于50kb的DNA，比较难做显微注射；而～kb以上的DNA进行微注射难以成功得到完整的转基因。
普通转基因动物使用质粒作为载体，缺点是质粒DNA克隆的容量太小，不能克隆大的基因和表达调控元件，如位点控制元件。转基因整合数即转基因拷贝的数目通常和DNA片段大小呈反比。因此，越大的DNA片段越难整合成功。
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有些图片来自于网络（侵删）
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